細胞名稱：綿羊肺成纖維細胞（原代永生化）

 OAR-L1  

細胞培養(yǎng)條件：DMEM+10%FBS+1%P/S

生長狀態(tài)：貼壁生長

細胞是生物學(xué)實驗的重要材料，也是生物細胞學(xué)實驗的基礎(chǔ)，藥物、基因功能、疾病機理等的相關(guān)研究多數(shù)需要在細胞水平進行闡釋。而細胞培養(yǎng)，受人員操作和環(huán)境條件的影響比較大，在細胞培養(yǎng)中常常會遇到很多的細節(jié)問題，而每個問題都有可能導(dǎo)致細胞培養(yǎng)的失敗。我們匯總了細胞實驗室多年來的細胞培養(yǎng)經(jīng)驗分享給大家，希望能給大家的細胞培養(yǎng)帶來幫助。

一．細胞系身份需明確

 我們之所以選定某種細胞系開展實驗，是因為所選細胞系的一些特性符合研究方向的設(shè)定。比如組織特性，疾病特性，功能特性，基因表達特性等。一旦用錯了細胞株，對我們研究結(jié)果的判斷就會帶來很大的誤差和不確定性。

而近年來，多個機構(gòu)發(fā)現(xiàn)細胞系在培養(yǎng)和流通過程中，出現(xiàn)了很嚴重的交叉污染。據(jù)不*統(tǒng)計，單就HeLa細胞系導(dǎo)致的污染致使3萬多篇論文結(jié)果的準確性存在問題（doi:10.1371/journal.pone.0186281）。而這種情況不僅僅限于HeLa細胞。多個機構(gòu)研究人員檢測發(fā)現(xiàn)超過451個細胞系已被其它細胞*吸收，在所檢測細胞中污染占比46%，可見細胞交叉污染的現(xiàn)象非常普遍。因此，做實驗前對細胞株驗明正身非常重要。如果是在機構(gòu)購買的細胞株，最好能讓供方提供合格的STR鑒定報告。

目前，STR基因分型方法是進行細胞交叉污染和性質(zhì)鑒定的*和準確的方法之一，是ATCC等機構(gòu)認定的金標準。不過可惜的是并非所有細胞均可進行STR鑒定，目前只有大部分的人源細胞株和45個種類的小鼠細胞株可以進行鑒定。其他細胞株可以結(jié)合細胞形態(tài)、特性和物種鑒定來進行確認。

二．培養(yǎng)、傳代、凍存和復(fù)蘇

1.準備工作：

根據(jù)培養(yǎng)細胞的特性，提前準備好適合的培養(yǎng)基和血清等。最好沿用細胞原來的培養(yǎng)條件，以免細胞在新環(huán)境下還需要過渡適應(yīng)。同時，充分了解到細胞的生長特性和形態(tài)特征，便于后續(xù)的培養(yǎng)觀察。

2.貼壁細胞傳代：

1）移棄使用過的細胞培養(yǎng)液。（不要直接倒掉，避免瓶口殘留導(dǎo)致易污染）

2）使用不含鈣鎂離子的平衡鹽溶液（PBS）沖洗細胞。從與貼壁細胞層相對的容器一側(cè)輕輕加入沖洗液，以避免攪動細胞層，前后搖晃容器數(shù)次，最后移棄沖洗液。（洗去殘留的血清，避免影響胰酶的活性。）

3）以 25 cm2的培養(yǎng)瓶為例，向瓶內(nèi)加入1ml胰蛋白酶-EDTA（請根據(jù)各細胞的指引使用合適的濃度）消化液，輕輕搖動培養(yǎng)瓶，使消化液流遍所有細胞表面，放到37 ℃ 孵育。通常，幾分鐘內(nèi)，會發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)回縮、細胞間隙增大，傾斜培養(yǎng)瓶時細胞層能自然流下，此時應(yīng)加入2-3ml含血清的*培養(yǎng)液終止消化（細胞解離所需時間請參考各細胞的指引，并建議每隔30秒在顯微鏡下觀察細胞的解離情況）。另外，并不是所有貼壁細胞都適用采用胰蛋白酶進行解離，請根據(jù)各細胞的指引選擇合適的解離方法。

4）使培養(yǎng)瓶傾斜，吸取培養(yǎng)瓶內(nèi)液體輕輕沖向原細胞生長表面，重復(fù)該動作2-3次，使所有細胞沿瓶底流下，再輕柔地把細胞吹打成單個懸液（吹打過程中應(yīng)避免氣泡的產(chǎn)生）。

PS：對于難消化的細胞，盡量不要通過用力吹打的方式來處理，以免對細胞產(chǎn)生物理損傷。可以先將已經(jīng)消化的細胞分出來，及時終止消化。然后再對仍然貼壁的細胞進行再次消化。做到分層消化，避免易消化細胞長時間在胰酶消化下受損。

5）把所有的細胞懸液轉(zhuǎn)移到15ml離心管中，800-1000rpm離心3-5分鐘后移棄上清。

6）加入新的含血清*培養(yǎng)液重懸成單細胞懸液。按各細胞指引推薦的傳代比例，把細胞懸液均勻分到各培養(yǎng)器皿中，補足新的含血清*培養(yǎng)液，輕輕搖晃混勻。

7）放到37 ℃ 孵育，第二天顯微鏡下觀察細胞的貼壁情況。

3.懸浮細胞傳代：

因懸浮生長細胞不貼壁，故傳代時不必采用酶消化方法，而可直接傳代或離心收集細胞后傳代。

1）直接傳代時，靜置5-10分鐘，待懸浮細胞慢慢沉淀到器皿底部后，吸掉1/2-2/3原培養(yǎng)液，補足新鮮的含血清*培養(yǎng)液，混勻成細胞懸液。按各細胞指引推薦的傳代比例，把細胞懸液均勻分到各培養(yǎng)器皿中，輕輕搖晃混勻。

2）離心傳代時，將細胞連同培養(yǎng)液一并轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，800-1000rpm離心3-5分鐘，移棄上清后，加入新鮮的含血清*培養(yǎng)液重懸。按各細胞指引推薦的傳代比例，把細胞懸液均勻分到各培養(yǎng)器皿中，補足新鮮的含血清*培養(yǎng)液，輕輕搖晃混勻。

3）放到37 ℃ 孵育，第二天顯微鏡下觀察細胞的情況。

4.貼壁懸浮混合型細胞傳代：

先將懸浮的細胞收集，再參考“貼壁細胞傳代"方法進行消化收集，一起接種到培養(yǎng)器皿中。

PS: 懸浮細胞生長中一般對細胞密度要求比較高，培養(yǎng)中最好參考指南控制好細胞密度，不能過密也不能過稀。

5.細胞凍存：

1）按照“細胞傳代步驟"中的方法收集細胞。

2）加入細胞凍存液（一般10%DMSO+對應(yīng)細胞的*培養(yǎng)液），使細胞的終密度為(5~10)×105個/ml，移入細胞凍存管中。

3）程序降溫（以使用需異丙醇的Nalgene程序降溫盒為例）：4℃ 30min→-80℃過夜→液氮。（一定不能省略4℃的30min，否則凍存液無法滲透到細胞，易產(chǎn)生冰晶導(dǎo)致細胞受損。）

6.細胞復(fù)蘇：

1）取出貯存的細胞，待液氮揮發(fā)后，馬上37℃水浴中輕輕搖動使快速融化（通常2min內(nèi)，時間長了細胞狀態(tài)會受影響）。為避免劇烈的溫差變化導(dǎo)致凍存管炸裂，操作該步時請配戴防護面罩或防護目鏡。

PS：干冰運輸?shù)膬龃婕毎盏胶笮枰⒖谭湃肷畹蜏乇浠蛞旱校辽?/span>3d后再進行復(fù)蘇操作。

2）轉(zhuǎn)移到無菌操作臺，75%酒精擦拭凍存管外部。

3）將細胞懸液轉(zhuǎn)移到裝有10-20ml經(jīng)預(yù)熱的含血清*培養(yǎng)液離心管中，800-1000rpm離心3-5分鐘，移棄上清。

4）重新加入經(jīng)預(yù)熱的含血清*培養(yǎng)液重懸細胞，以約(3~5)×105個/ml密度接種到培養(yǎng)器皿中。

5）放到37℃孵育，第二天顯微鏡下觀察細胞的情況。

大鼠 肺微血管內(nèi)皮細胞

大鼠 肺動脈內(nèi)皮細胞

大鼠 肺動脈平滑肌細胞

大鼠 肺動脈外膜成纖維細胞

大鼠 II型肺泡上皮細胞

大鼠 氣管上皮細胞

大鼠 氣管平滑肌細胞

大鼠 支氣管上皮細胞

大鼠 支氣管平滑肌細胞

大鼠 肺成纖維細胞

大鼠 肺巨噬細胞

大鼠 肺微血管周細胞

大鼠 心肌細胞

大鼠 心肌成纖維細胞

大鼠 主動脈內(nèi)皮細胞

大鼠 主動脈平滑肌細胞

大鼠 主動脈外膜成纖維細胞

大鼠 冠狀動脈內(nèi)皮細胞

大鼠 冠狀動脈平滑肌細胞

大鼠 頸動脈內(nèi)皮細胞

大鼠 頸動脈平滑肌細胞

大鼠 腹腔主動脈內(nèi)皮細胞

大鼠 腹腔主動脈平滑肌細胞

大鼠 腹腔主動脈外膜成纖維細胞

大鼠 股動脈內(nèi)皮細胞

大鼠 股動脈平滑肌細胞

大鼠 心肌干細胞

大鼠 主動脈弓平滑肌細胞

大鼠 主動脈弓內(nèi)皮細胞

大鼠 心臟微血管內(nèi)皮細胞

大鼠 頸動脈成纖維細胞

大鼠 頸靜脈內(nèi)皮細胞

大鼠 主動脈瓣膜間質(zhì)細胞

大鼠 食管上皮細胞

大鼠 食管平滑肌細胞

大鼠 食管成纖維細胞

大鼠 胃粘膜上皮細胞

大鼠 胃平滑肌細胞

大鼠 胃成纖維細胞

大鼠 小腸黏膜上皮細胞

大鼠 小腸平滑肌細胞

大鼠 小腸隱窩上皮細胞

大鼠 小腸成纖維細胞

大鼠 結(jié)腸粘膜上皮細胞

大鼠 結(jié)腸平滑肌細胞

大鼠 結(jié)腸成纖維細胞

大鼠 膽囊上皮細胞

大鼠 肝內(nèi)膽管上皮細胞

大鼠 肝外膽管上皮細胞

大鼠 肝實質(zhì)細胞

大鼠 肝星狀細胞

大鼠 肝竇內(nèi)皮細胞

大鼠 肝Kupffer細胞

大鼠 結(jié)腸神經(jīng)元細胞

大鼠 肝間質(zhì)細胞

大鼠 肝成纖維細胞

大鼠 腸間質(zhì)細胞

大鼠 腎小管上皮細胞

大鼠 腎小球系膜細胞

大鼠 腎小球內(nèi)皮細胞

大鼠 腎足細胞

大鼠 輸尿管上皮細胞

大鼠 輸尿管平滑肌細胞

大鼠 膀胱上皮細胞

大鼠 膀胱平滑肌細胞

大鼠 膀胱基質(zhì)成纖維細胞

大鼠 前列腺上皮細胞

大鼠 前列腺成纖維細胞

大鼠 腎周細胞

大鼠 甲狀腺上皮細胞

大鼠 甲狀腺成纖維細胞

大鼠 胰腺星狀細胞

大鼠 胰島細胞

大鼠 垂體細胞

大鼠 胸腺細胞

大鼠 胸腺基質(zhì)細胞

大鼠 頜下腺上皮細胞

大鼠 腎上腺皮質(zhì)細胞

大鼠 腎上腺髓質(zhì)細胞

大鼠 精原細胞

大鼠 睪丸支持細胞

大鼠 海綿體平滑肌細胞

大鼠 卵巢顆粒細胞

大鼠 卵巢間質(zhì)細胞

大鼠 輸卵管上皮細胞

大鼠 輸卵管平滑肌細胞

大鼠 子宮內(nèi)膜上皮細胞

大鼠 子宮內(nèi)膜平滑肌細胞

大鼠 卵巢表面上皮細胞

大鼠 乳腺上皮細胞

大鼠 乳腺成纖維細胞

大鼠 卵巢內(nèi)膜細胞

大鼠 子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞

大鼠 睪丸間質(zhì)細胞

大鼠 子宮成纖維細胞

大鼠 骨細胞

大鼠 成骨細胞

大鼠 軟骨細胞

大鼠 滑膜成纖維細胞

大鼠 骨骼肌細胞

大鼠 骨骼肌成纖維細胞

大鼠 纖維環(huán)細胞

大鼠 髓核細胞

大鼠 破骨細胞

大鼠 皮膚成纖維細胞

大鼠 角質(zhì)形成細胞

大鼠 表皮干細胞

大鼠 前脂肪細胞

大鼠 脂肪微血管內(nèi)皮細胞

大鼠 真皮毛乳頭細胞

大鼠 外根鞘細胞

大鼠 毛囊角質(zhì)細胞

大鼠 骨髓間充質(zhì)干細胞

大鼠 脂肪干細胞

大鼠 滑膜間充質(zhì)干細胞

大鼠 B淋巴細胞

大鼠 T淋巴細胞

大鼠 單核細胞

大鼠 DC細胞

大鼠 NK細胞

大鼠 內(nèi)皮祖細胞

大鼠 胸腺上皮細胞

大鼠 胸腺成纖維細胞

大鼠 脾基質(zhì)細胞

大鼠 脾源性內(nèi)皮祖細胞

大鼠 淋巴管內(nèi)皮細胞

大鼠 淋巴管成纖維細胞

大鼠 骨髓肥大細胞

大鼠 骨髓單核細胞

大鼠 脾淋巴細胞

大鼠 骨髓巨噬細胞

大鼠 腦微血管內(nèi)皮細胞

大鼠 腦動脈血管內(nèi)皮細胞

大鼠 腦血管周細胞

大鼠 腦膜細胞

大鼠 腦皮層神經(jīng)元細胞

大鼠 海馬神經(jīng)元細胞

大鼠 脊髓神經(jīng)元細胞

大鼠 雪旺細胞

大鼠 星形膠質(zhì)細胞

大鼠 小膠質(zhì)細胞

大鼠 少突膠質(zhì)細胞

大鼠 神經(jīng)膠質(zhì)細胞

大鼠 腦動脈平滑肌細胞

大鼠 神經(jīng)干細胞

大鼠 腦血管成纖維細胞

大鼠 DRG神經(jīng)元細胞

大鼠 下丘腦神經(jīng)元細胞

大鼠 角膜上皮細胞

大鼠 角膜基質(zhì)細胞

大鼠 視網(wǎng)膜色素上皮細胞

大鼠 晶狀體上皮細胞

大鼠 結(jié)膜成纖維細胞

大鼠 結(jié)膜上皮細胞

大鼠 脈絡(luò)膜微血管內(nèi)皮細胞

大鼠 脈絡(luò)膜成纖維細胞

大鼠 視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細胞

大鼠 牙周膜成纖維細胞

大鼠 牙周膜干細胞

大鼠 牙髓干細胞

大鼠 口腔黏膜上皮細胞

大鼠 舌表皮細胞

大鼠 鼓膜上皮干細胞

大鼠 角膜內(nèi)皮細胞

大鼠 鞏膜上皮細胞

大鼠 視網(wǎng)膜mulller細胞

大鼠 胎盤間充質(zhì)干細胞

大鼠 胚胎成纖維細胞

綿羊肺成纖維細胞（原代永生化）

三.污染防治

1.細菌污染

細菌污染是細胞培養(yǎng)中最常見的污染，主要由操作不慎或使用了滅菌不*的耗材與試劑引入。最常見的有枯草桿菌、大腸桿菌、假單胞菌及白色葡萄球菌。鏡下形態(tài)則為長桿狀、短桿狀和顆粒狀等。

好氧菌增殖分裂迅速，感染24h內(nèi)即可使培養(yǎng)基渾濁；厭氧菌在常規(guī)細胞培養(yǎng)條件下增殖緩慢，需要較長時間才會觀察到渾濁現(xiàn)象。

污染處理：由于國內(nèi)細胞培養(yǎng)中抗生素使用泛濫，所以出現(xiàn)污染后加雙抗（青霉素&鏈霉素，Penicillin + Streptomycin）一般沒有效果。桿菌可選用100ug/ml慶大霉素處理一周，顆粒狀細菌可用25ug/ml環(huán)丙沙星處理一周，效果相對還不錯。

2. 真菌污染

細胞培養(yǎng)中最常見的污染真菌有：煙曲霉、黑曲菌、毛霉菌、白色念珠菌、酵母菌等。

左邊這張是比較典型的霉菌污染的圖片，右圖是酵母污染，鏡下可以看到明顯的出芽形態(tài)。

污染處理：可用100ug兩性霉素/T25瓶，處理一周。

注：性較大，需要在細胞有50%以上且狀態(tài)沒受大影響前處理。