可以這樣說，對于需要消化傳代的細胞，每一次的消化都是對這個細胞存活與否，狀態好與不好最至關重要的考驗。

在消化的過程中，你加入胰酶后，所有細胞都在被胰酶消化著，但是我們忽視了一個問題。細胞的生長狀態是不一樣的，每一個細胞的貼壁情況也是不一樣的。我后來對消化的方法進行了改良，我稱之為「四步消化法」。以難消化細胞為例，具體操作如下：

首先不加胰酶，倒掉舊培養基加入少量新培養基洗 1-2 遍，目的是將漂浮著的死細胞之類盡量洗掉。

然后再加入少量新培養基直接吹打一遍，這一遍是把貼壁不牢固的細胞吹打下來。再用培養基洗一遍，兩次所得懸液混合傳入新瓶。你可以將這些傳入新瓶培養，以與后面胰酶消化過的細胞對比觀察看誰長的更好一點就知道該細胞對胰酶的敏感度。

吸干凈瓶內剩余液體，加入 0.3 ml 左右的胰酶潤洗一遍，吸掉棄之，再加入 1 ml 左右的胰酶消化。消化的同時置于顯微鏡下觀察，待細胞與細胞之間間隙明顯的時候立即吸掉胰酶與干凈里備用，加入新培養基開始吹打，吹打 2-3 遍后吸取懸液于試管或新瓶暫存。用 2 ml 左右新培養基洗一遍與前面的混合。你也可以傳入新瓶培養，以與后面及前面的做對比。

然后把前面剛吸出來的胰酶重新加進瓶里，繼續消化剩余的貼壁牢固的細胞。當然你也可以用新的胰酶。繼續鏡下觀察，待剩余細胞間隙明顯，細胞獨立開來的時候，吸掉胰酶，加入新培養基吹打。懸液傳入新瓶培養，根據你實際情況自己把握。

其實還可以有第五步，對于特別難消化的細胞和對胰酶特別敏感的細胞的話，你可以繼續加第五步甚至第六步。為了細胞更好的狀態，更漂亮的樣子，沒辦法，你必須分多批多次消化，這樣才能最大限度地將胰酶對細胞的損傷降到低，保證細胞的狀態能夠優。

當然了，如果細胞是屬于那種很容易消化的細胞，像 RAW264.7，僅僅第二步就搞定。就沒必要第三步第四步了。這個需要你在實驗中自己用心去體會。建議你接受一個新細胞時把各步消化的細胞分別培養起來做比較，去摸索好細胞對胰酶的要求。便于你后續實驗的開展。

將細胞消化分成這幾步，除了是為了避免胰酶對細胞的損傷之外，還有一個更重要的作用就是，可以程度地把細胞吹打成單個單個的狀態，不成片不連體。

因為細胞生長的時候肯定是要相互聯系，大部分的細胞都是要成片生長的，尤其是對于貼壁細胞，單個細胞貼壁之后長著長著就長到一片去了。但是如果是成片的細胞抱團的話，傳代后細胞是不能貼壁的，這樣抱團的細胞就會死亡。所以，消化傳代的時候一定要將細胞消化成單個的獨立狀態，這個非常考究你的功夫。

細胞一旦脫落入懸液里，你很難再將他吹打成單個。所以必須要在細胞未脫落之前將其吹打開，受力點就是細胞貼壁的地方。既要消化到容易吹打下來，又不能太過，一吹就整片脫落，要單個單個地往下掉。所以我才要分批分次地加胰酶消化就是為了保證不同生長狀態貼壁程度的細胞能夠都維持在好的受力點分散開。這個是很重要的一點。

另外關于傳代很重要一點就是，一定不能等到細胞長滿的時候才去消化傳代。要在細胞長到 70% 左右的時候就要傳代了，一旦發現細胞生長中已經有疊層生長的時候就要立即進行消化傳代。不能再拖了。

千舍生物部分細胞*：

5637 人膀胱癌細胞

293T 人腎細胞

3T3-L1  小鼠胚胎成纖維細胞(前脂肪)

786-O   人腎透明細胞腺癌細胞

A375 人惡性黑色素瘤細胞

A431 人表皮癌細胞

A549 人肺腺癌細胞

AAV-293 人胚腎細胞

ARPE-19 人視網膜上皮細胞

AsPC-1 胰腺導管腺癌

AV3 人宮頸癌細胞

B16 小鼠黑色素瘤細胞

BCPAP 人甲狀腺癌乳頭狀細胞

Bend.3 小鼠腦微血管內皮細胞

BT-474 人乳腺導管癌細胞

BT-B 人膀胱癌細胞

BV-2 小鼠小膠質瘤細胞

C6 大鼠膠質瘤細胞

CaCO2 人結直腸腺癌細胞

CALU-6 人肺腺癌細胞

chang liver 人張氏肝細胞/人乳頭瘤病毒相關的子宮頸腺癌細胞

CHO-K1 中國倉鼠卵巢細胞系

COLO320 人結腸癌細胞

COLO320-GFP-puro(GHRLOS過表達)

COLO320-GFP-puro(LV5-NC)

COS-7 非洲綠猴腎細胞

CT26.wt       小鼠結腸癌細胞

DAMI 人巨核細胞白血病細胞

DC2.4 小鼠樹突狀細胞

DF-1 雞胚成纖維細胞系

DU145    人前列腺癌細胞

ECV-304 人臍靜脈內皮細胞株

EH-GB1 首株來源于轉移灶的人膽囊癌細胞系

FaDu 人咽鱗癌細胞

GBC-SD 人膽囊癌細胞系

GH3 大鼠垂體瘤細胞

GT1.1 小鼠垂體瘤細胞

H446 人非小細胞肺癌細胞

H9C2（2-1） 大鼠心肌細胞

HaCaT 人永生化表皮細胞

HCC15 鱗狀細胞肺癌

HCCLM3 人高轉移肝癌細胞

HCT116 人結腸癌細胞

HCT-116/L-OHP 人結腸癌奧沙利鉑耐藥細胞

HCT-8 人結腸癌細胞

HDF 人真皮成纖維細胞

HEL    人紅白細胞白血病細胞

HELA 人宮頸癌癌細胞

HELA-LUCI Luciferase穩定表達Hela細胞

HEPG2 人肝癌細胞

HFF-1 人包皮成纖維細胞

HGC-27 人胃癌細胞(未分化)

HK-2 人腎小管上皮細胞

HO8910PM 人高轉移卵巢漿液性囊腺癌細胞

Hs578T 人乳腺癌細胞（浸潤性導管癌）

HT-29   人結腸癌細胞

HUCCT1 人膽管細胞癌

I Shikawa 人子宮內膜癌細胞

J774A.1 小鼠單核巨噬細胞

J82    人膀胱癌細胞

K562 慢性粒細胞白血病細胞

KYSE150 人食管鱗癌細胞

L02 人正常肝細胞

L6 大鼠成肌細胞

L929 小鼠成纖維細胞

LLC 小鼠 Lewis(肺癌細胞)

LOVO 人結直腸癌細胞

LX-2 人肝星狀細胞

MC3T3-E1 小鼠胚胎成骨細胞前體細胞

MCF-10A 人正常乳腺細胞

MDA-MB-231 乳腺癌細胞

MDBK 牛腎細胞

MDCK 狗腎轉化細胞

MG63 人成骨肉瘤細胞

MIA PaCa-2 胰腺癌細胞系

MKN28 人胃癌細胞

MKN45 人胃癌細胞

MKN74 人胃癌細胞

mMSC 小鼠間充質干細胞

MOLT4 成人T急性淋巴細胞白血病細胞

NCI-H1650 微創肺腺癌細胞

NCI-H1975 人非小細胞肺腺癌細胞

NCI-H460     大細胞肺癌細胞

NIH-3T3 小鼠胚胎成纖維細胞

OVCAR-3 人卵巢癌細胞

OVCAR-8 高級別卵巢漿液性腺癌細胞

P53R(JHU-56) 人結直腸癌細胞

PANC-1    人胰腺癌細胞

PANC-1 GFP-NC 人胰腺癌細胞 帶綠色熒光

PANC-1 TRPM2-siRNA 人胰腺癌細胞 TRPM2基因抑制

PA-TU-8988T 人胰腺細胞

PC-12（低分化） 大鼠腎上腺髓質嗜鉻瘤分化細胞株

PC-12(高分化)   大鼠腎上腺髓質嗜鉻瘤分化細胞株

PECA 小鼠皮膚鱗狀細胞癌

PH 成人急性單核細胞白血病

PK-15 豬腎細胞

Raji 人B淋巴瘤細胞

RAW264.7   小鼠單核細胞

RSC96 大鼠雪旺細胞

Saos-2 人成骨肉瘤細胞

SCL-1 人皮膚鱗癌細胞

SK-BR-3 人乳腺癌傳代細胞

SK-OV-3 人卵巢癌細胞

SMMC-7721 人肝癌細胞

SNU-899 上呼吸消化道鱗狀細胞癌

SPEC-2 子宮內膜漿液性表面乳頭狀癌細胞

ST 豬胎睪丸細胞

SU-DHL-6 彌漫性大B細胞淋巴瘤生發中心B細胞型

SV40 MES 13 小鼠腎小球系膜細胞

SV-HUC-1 人正常膀胱上皮細胞

SW480   人結直腸癌細胞

SW620 人結腸腺癌細胞

SW900 肺鱗狀細胞癌

T24   人膀胱移行細胞癌細胞

TE-1 人食管癌細胞

THP-1 人急性單核細胞白血病單核細胞株

TM3 小鼠睪丸間質細胞

TPC-1 人甲狀腺乳頭狀癌的細胞系

U118MG 人星形膠質細胞

U266 人骨髓瘤細胞

U87MG  人腦星形膠質母細胞瘤

WiDr 人大腸癌細胞

Yac-1 小鼠淋巴瘤細胞

山羊MSC細胞 山羊骨髓間充質干細胞

山羊關節軟骨細胞