蘇州千舍生物-細胞培養知識之細胞液黑色運動顆粒物

在細胞培養中常可見到細胞及培養液中有一些大小不等、形態不同的黑色顆粒在運動。如果鏡下檢查(100x)每視野計數在10個以上者就可能使細胞生長受到影響，如果其數量再增多細胞可停止增殖繼而死亡。人們常稱這種顆粒為黑膠蟲或中毒顆粒。

一、關于黑膠蟲的描述

1、分類上的描述：對于黑膠蟲的分類，學術界沒有明確給予說法。關于黑膠蟲的分類，目前大部分人認為黑膠蟲污染是微生物感染。在一些文章論述上把黑膠蟲歸為生物污染類型，但是沒把它歸為確定的生物分類類型，只是把黑膠蟲獨立為一種未知生物。而根據中國病毒所和軍科院鑒定是一種寄生于牛血清內的一種原蟲，似乎和草履蟲和變形蟲有類似之處，但是由于課題經費不夠而不能繼續下去，終也沒有有力證明黑膠蟲是屬于原蟲。也有一些學者不認為所謂的黑膠蟲污染是一種生物污染，而認為是細胞碎片類物質，是在細胞培養時，細胞衰亡破裂產生的；也有在文獻中報道說是玻璃瓶中類似氧化硅的物質，那個文獻很少人找得到；還有報道黒膠蟲是一種納米級的細菌。

2、形態上的描述：形態上類似與桿狀細菌，但長度比細菌長，直徑約在0.5~1微米，顯微鏡觀察為黑色，膠蟲成熟后呈線狀，而且形態是橢圓形。

運動形式：在400x倒置顯微鏡小，有典型的布朗運動（不規則的原地小距離抖動），即很多細胞培養者看到的，像黑色的小蟲游來游去。可以穿透濾膜，也可以通過空氣傳播，低倍下為黑色點狀，高倍下可看見黑色的小蟲游來游去。但是在物理學上來說，顆粒足夠小，在液體中也是做布朗運動的，這不足以說明黑膠蟲的布朗運動就證明它是生物。

3、生理上的描述：

3.1抗性

抗細菌和抗霉菌的藥物對黑膠蟲均無效，可以保守的判定黑膠蟲不屬于細菌。

3.2環境抗逆性

將培養器材150度烘烤8小時，可以消除，而黑膠蟲高壓滅菌泡酸都不死。可見黑膠蟲可以耐高溫高壓，而且還有點嗜酸，如果證實它是生物的話，那它很有可能是微生物，一種古菌。

3.3營養條件

“黑膠蟲”可寄生于動物細胞，也可以生存于培養基中，依靠細胞和培養基中的營養為生，并隨細胞傳代而傳代。可見“黑膠蟲”可能是一種異養生物。

二、對黑膠蟲的各種猜測

1.非生物類

1.1細胞碎片類

在細胞培養的時候， 由于細胞代謝、物質交換、周邊環境變化，尤其是在從37度培養箱中拿出來觀察的過程中，由于液體培養基的比熱較大，液內溫度高于外界溫度，造成冷熱交換、小范圍內形成液體流動加劇，當然這些小歲末就會被攪動起來形成似乎“游動”的感覺；隨著細胞培養的繼續，部分細胞開始衰亡，細胞膜結構破裂，破裂之后的細胞內容物泄露到培養液中。尤其是溶酶體的破壞，連續性地造成其他細胞和細胞器的損傷，如果換液不很勤，又會出現進一步破壞和殘渣的出現；再者，“黑膠蟲”問題是很多細胞培養者已經發現的問題，但到目前為止尚未找到其監測和排除的試劑和手段，這首先是由于所謂“黑膠蟲”病原體根本難以收集和捕捉，這也從另一個側面證明了“黑膠蟲”問題的難以確定性；再說任何一種外來的微生物在培養基中都會有生命活動的反應和表現，而不是簡單地運動那樣的外觀性表現。舉一個例子：如果“黑膠蟲”的運動狀況已經到了用顯微鏡已經可以觀察出的程度，其營養代謝和能量需求也就可想而知。這樣，培養液中的影響消耗、酸堿含量程度等都要發生明顯變化。比如說：迅速的、大含量的沉淀，pH值的迅速下降，細胞大量破碎死亡、引發其它類型微生物侵染等等。而這些狀況，在所謂的“黑膠蟲”感染中，是很難觀察到的。同時“黑膠蟲”的出現而影響細胞狀態似乎得不到有力的證據。倒是細胞狀態下降的時候，“黑膠蟲”明顯增多了。很有可能是細胞狀態下降時，細胞衰亡產生的細胞碎片。所以黑膠蟲屬于細胞碎片是比較可能和合理的。

1.2玻璃培養瓶中的類似氧化硅的東西

網上有一篇文章說，黑膠蟲其實不是一種生物，是無機物，其本質是玻璃培養瓶里的硅顆粒。可影響細胞生長，細胞狀態好時，不明顯。細胞狀態較差，數量少時才容易看到，的辦法是用一次性培養瓶，可消除黑膠蟲影響。

血清聚合物產物

Hyclone胎牛血清SH30084.03  、Hyclone胎牛血清SH30406.02  、Hyclone胎牛血清SH30406.05 、Hyclone胎牛血清SH30396.03  、Hyclone胎牛血清SH30070.03

特級胎牛血清 SH30070.03E 、Hyclone胎牛血清 SH30370.03  、活性炭/葡聚糖胎牛血清 SH30068.03  、活性炭/葡聚糖處理胎牛血清，熱滅活 SH30068.03HI 、馬血清SH30074.03  、烏拉圭胎牛血清 SV30087. 03 、Hyclone胎牛血清SH30071.03 、Hyclone胎牛血清SV30160.03。

BOVOGEN胎牛血清 SFBS 、BOVOGEN新生牛血清 SNCS。

PAA 普通胎牛血清FBS A15-101 、PAA 優等胎牛血清FBS A15-151。

BI優等胎牛血清 04-001-1ACS 、BI ES級別胎牛血清 04-002-1A 、

BI 間充質胎牛血清 04-400-1A 。

Corning胎牛血清 35-076-CV。

PAN胎牛血清FBS P30-3302  、PAN胎牛血清FBS ST30-3302 、PAN ES級別胎牛血清 ST30-2602 、PAN胎牛血清Plus ST30-3302P 。

NTC優等胎牛血清 SFBE。

Gemini優等胎牛血清 900-108 、Gemini特級胎牛血清 100-500  、Gemini科研用人AB血清100-512 。

TCB胎牛血清 101ZC。

Sigma 特級胎牛血清F2442 、Sigma正常人AB血清 H4522 。

SBI 無外泌體血清 EXO-FBS-50A-1

胎牛血清盒裝A31608-02、馬血清16050-122。

雙抗15140-122、SV30010  、胰酶 25200-056、SH30042.01 、GIBCO 胰酶 25200-072。

MCF7/Taxol人乳腺癌紫杉醇耐藥株

HCT8/5-fu 人回腸直腸腺癌細胞五氟尿嘧啶耐藥株

LOVO/5-FU 人結腸癌細胞五氟尿嘧啶耐藥株

HCT116/L人結腸癌奧沙利鉑耐藥細胞

HL60/ADR人早幼粒急性白血病細胞耐阿霉素株

PC9GR(PC9R)人肺癌細胞耐吉非替尼

LOVO/ADR人結腸癌細胞阿霉素耐藥株

HNE1/DDP人鼻咽癌細胞順鉑耐藥株

SGC7901/5-fu人胃癌細胞五氟尿嘧啶耐藥株

A549/DDP人肺癌細胞順鉑耐藥株

MCF-7/DDP人乳腺癌細胞順鉑耐藥株

A549/ADR人肺癌細胞阿霉素耐藥株

SGC7901/DDP人胃癌細胞順鉑耐藥株

SKOV3/DDP人卵巢癌細胞順鉑耐藥株

HELA/DDP人宮頸癌耐順鉑細胞株

NCI-H1650 人肺支氣管癌細胞

RT4 人膀胱移行細胞乳頭瘤 、SK-N-MC 人神經上皮瘤細胞

SK-N-SH 人神經母細胞瘤細胞 、SW982 人滑膜肉瘤細胞

T98G 人膠質母細胞瘤 、U251MG(KO) 人類星形膠質細胞瘤細胞

U266 人骨髓瘤細胞 、VCAP 人前列腺癌細胞

hTERT-HPNE 人胰腺導管細胞 、ES-2 人卵巢透明細胞癌細胞

NCI-H1650人非小細胞肺癌細胞 、H460 人大細胞肺癌細胞

HACAT 人永生化角質形成細胞 、HCT116 人結腸癌細胞

HEK293 人胚腎細胞  、HEPG2 人肝癌細胞

HGC27 人胃癌細胞(未分化) 、HT-29 人結腸癌細胞

HUVEC 人臍靜脈內皮細胞 、KYSE150人食道癌細胞

L02(HL7702)人正常肝細胞   、LOVO 人結腸癌細胞

MCF-10A人正常乳腺上皮細胞 、MCF7人乳腺癌細胞

LX-2 人肝星狀細胞 、MDA-MB-468人乳腺癌細胞

2、生物類

2.1支原體

有人曾認為黑膠蟲可能是支原體污染，因為相對比較quan 威的網站文章指出，黑膠蟲可以通過濾膜，可以在空氣中傳播。而恰巧口腔支原體為人體口腔中之正常菌叢，所以實驗室之操作人員的污染亦可能為支原體的污染源。但有人為此做了實驗證明黑膠蟲不會是支原體，原因如下：

a、光鏡下可見，因為體積不對，支原體在普通顯微鏡下不能看到。

b、多種染色后可見，甚至hoechst即能將它染色，一般來說支原體用普通染色法不易著色，用姬姆薩染色很淺，革蘭染色為陰性。所以，黑膠蟲是一種支原體的可能性比較小。

2.2真菌

有很多人發現類似黑膠蟲的，但后確定是真菌，二性霉素B對其有效。那說明黑膠蟲不存在只是細胞培養中的真菌感染，還是說明黑膠蟲污染屬于真菌類污染物。如果黑膠蟲是一種真菌，那么由此引起的污染是不會引起那么多人的關注，即使它很特殊。但是這不能排除那些認為“黑膠蟲”是真菌的細胞者，看到的只是一般真菌感染。由于細胞被感染了，要進行拯救處理，不像理論上那么簡單，稍有不注意都是很容易導致培養失敗，所以黑膠蟲是一種真菌也是不太可能。

2.3寄生類原蟲

黑膠蟲屬于寄生類的原蟲，而不是細菌、支原體，也不是什么補體、細胞碎片或蛋白沉淀。有人在400倍以上的高倍鏡下可以清楚的看到膠蟲有兩種不同形態，一種較大，運動較慢，泛紅光；另一種較小，運動較快，紅中帶綠，個小的圍著個大的分布，很可能是公的圍著雌的。這種生物也并非離開細胞就不能存活，也有人做過這樣的試驗，單純培養過污染膠蟲的血清4周，直到滿視野都是黑煤渣般的膠蟲。給人的感覺是膠蟲和細胞一樣有叢集性，如果膠蟲密度低則生長緩慢，如果手懶，拖了幾天沒換液，待膠蟲生長到一定濃度后便會飛速分生，細胞受感染的程度也大，這時除了培養基中可見外，細胞表面通常也象長滿了粉刺，所以有人認為細胞旁分泌的某些因子可以抑制膠蟲的生長。據說，中國病毒所和軍科院鑒定是一種寄生于牛血清內的一種原蟲，似乎和草履蟲和變形蟲有類似之處，然而由于課題經費不夠而不能繼續進行下去，所以并沒有明確的證據證明此項猜測的正確性。

三、解析

從前面關于黒膠蟲的描述可以看出，人們遇到的黒膠蟲并不都是一樣的，有像細菌的、有像支原體的、有像原蟲的、有像真菌的，還有像細胞碎片的。在國內各實驗室的器材條件參差不齊，而且實驗人員的操作質量也不盡相同，同一種現象也可能有些許差異，當用描述出來的現象的差異可能變大也可能變小。所以很多人看到細胞被細菌污染了，不好處理，而卻描述出來的現象和流傳的黑膠蟲類似，就會把培養失敗的原因歸結到無法處理的黒膠蟲污染，甚至可能說它發現的是真正的黑膠蟲。這樣的事情多了，黑膠蟲就會人為的變種，像什么的都有。黑膠蟲是否存在，還有待于科學的發展。但有一點可以肯定的，大部分人發現的“黒膠蟲”并不是真正那個未知的黒膠蟲，而是常見的細菌、真菌、原蟲等微生物污染。

關于黑膠蟲quan 威的報道。在《細胞生物學雜志》有一篇關于《對細胞培養中一種黑色運動顆粒性質的研究》論文，文中經過多種實驗驗證后指出：“在組織培養中常觀察到一種大小不等、形態不同的黑色運動顆粒，它對培養細胞的生長有不良影響，有時甚至導致細胞死亡，并能在一定條件下隨培養時間的增長而增加其數量。人們常稱這種顆粒為黑膠蟲或中毒顆粒，我們取細胞培養用的血清、培養基和其他材料中的黑色運動顆粒，應用光學顯微鏡、透射電鏡、掃描電鏡對其形態學進行系統觀察；并用顯微攝影觀察其活動情況；用紫外分光及電泳透析進行生化分析，結果均證明該顆粒為無膜式結構，無蛋白質成分，中性環境下帶正電荷，能譜掃描電鏡分析為硅復合物，我們稱之為硅小體(B)，證明其活動屬布朗運動。本文進一步用電感耦合等離子發射光譜分析了培養液及雙蒸水中可溶性的硅含量在不同質量的容器及不同時間的變化，證明了硅小體的增多主要來源于培養液對玻璃器皿的侵蝕，部分來源于被培養的細胞。