蘇州千舍生物教你如何挽救細胞污染

以自建細胞系(laryngeal squamous carcinoma-1，LSC-1)第12代的某一被細菌污染的細胞株采取救治，比較效果并分析細胞生物學特性。

一、實驗方法

1、抗生素法：

細菌培養：用無抗生素*培養液培養細胞3 d，收集上清離心后將沉淀物接種于血瓊脂培養基，35e培養。

所采用的抗生素包括臨床常用的15種抗生素，抗生素zui適抑菌濃度篩選:根據細菌藥敏實驗結果選出敏感抗生素，每種抗生素從zui低抑菌濃度MIC到zui高耐藥濃度分別配制6個濃度梯度。將LSC-1細胞按1*104/孔種96孔板，細胞貼壁后加入含敏感抗生素的*培養液，24 h后換無抗生素培養液培養1 d，如此重復3次，連續7 d。

2、抗生素聯合巨噬細胞吞噬法:

將上述抗生素處理過的細胞再用小鼠的巨噬細胞處理。巨噬細胞的制備:將滅菌的玻璃粉與0. 9%氯化鈉注射液混和注入小鼠腹腔， 3 d后脫頸處死動物，無菌操作取小鼠腹腔液，離心收集巨噬細胞，與LSC-1細胞混合培養， 3 d后換液，棄去巨噬細胞。間隔一周后再用巨噬細胞共培養一次。

3、裸鼠體內接種法:

將LSC-1細胞按1*106個/mL接種裸鼠腋下皮下，連續觀察，當腫物長至約1cm3后，脫頸處死動物，無菌操作取出腫物，采取組織塊法做組織細胞培養。

二、效果鑒定

1、免疫組織化學鑒定

將上述3種方法處理的LSC-1細胞種植在直徑為15 mm的無菌圓形蓋玻片上，貼壁后做角蛋白AE1 /AE3免疫組化染色、HE染色

2、細胞周期鑒定

采用流式細胞儀測量碘化丙啶標記細胞的熒光強度，分析DNA含量。測試3種方法處理的LSC-1細胞周期，并與該細胞建系初期的第3代細胞狀況做比對。

3、抗生素撤離觀察

用無抗生素的*培養基培養3種方法處理的細胞，連續觀察3周，取細胞上清做細菌培養。

Hyclone胎牛血清SH30084.03

Hyclone胎牛血清SH30406.02

Hyclone胎牛血清SH30406.05

Hyclone胎牛血清SH30396.03

Hyclone胎牛血清SH30070.03

特級胎牛血清 SH30070.03E

Hyclone胎牛血清 SH30370.03

活性炭/葡聚糖胎牛血清 SH30068.03

活性炭/葡聚糖處理胎牛血清，熱滅活 SH30068.03HI

馬血清SH30074.03

烏拉圭胎牛血清 SV30087. 03

Hyclone胎牛血清SH30071.03

Hyclone胎牛血清SV30160.03

BOVOGEN胎牛血清 SFBS

BOVOGEN新生牛血清 SNCS

PAA 普通胎牛血清FBS A15-101

PAA 優等胎牛血清FBS A15-151

BI優等胎牛血清 04-001-1ACS

BI ES級別胎牛血清 04-002-1A

BI 間充質胎牛血清 04-400-1A

Corning胎牛血清 35-076-CV

PAN胎牛血清FBS P30-3302

PAN胎牛血清FBS ST30-3302

PAN ES級別胎牛血清 ST30-2602

PAN胎牛血清Plus ST30-3302P

NTC優等胎牛血清 SFBE

Gemini優等胎牛血清 900-108

Gemini特級胎牛血清 100-500

Gemini科研用人AB血清100-512

TCB胎牛血清 101ZC

Sigma 特級胎牛血清F2442

Sigma正常人AB血清 H4522

SBI 無外泌體血清 EXO-FBS-50A-1

胎牛血清盒裝A31608-02、馬血清16050-122

雙抗15140-122、SV30010

胰酶 25200-056、SH30042.01

GIBCO 胰酶 25200-072

MCF7/Taxol人乳腺癌紫杉醇耐藥株

HCT8/5-fu 人回腸直腸腺癌細胞五氟尿嘧啶耐藥株

LOVO/5-FU 人結腸癌細胞五氟尿嘧啶耐藥株

HCT116/L人結腸癌奧沙利鉑耐藥細胞

HL60/ADR人早幼粒急性白血病細胞耐阿霉素株

PC9GR(PC9R)人肺癌細胞耐吉非替尼

LOVO/ADR人結腸癌細胞阿霉素耐藥株

HNE1/DDP人鼻咽癌細胞順鉑耐藥株

SGC7901/5-fu人胃癌細胞五氟尿嘧啶耐藥株

A549/DDP人肺癌細胞順鉑耐藥株

MCF-7/DDP人乳腺癌細胞順鉑耐藥株

A549/ADR人肺癌細胞阿霉素耐藥株

SGC7901/DDP人胃癌細胞順鉑耐藥株

SKOV3/DDP人卵巢癌細胞順鉑耐藥株

HELA/DDP人宮頸癌耐順鉑細胞株

NCI-H1650 人肺支氣管癌細胞

RT4 人膀胱移行細胞乳頭瘤

SK-N-MC 人神經上皮瘤細胞

SK-N-SH 人神經母細胞瘤細胞

SW982 人滑膜肉瘤細胞

T98G 人膠質母細胞瘤

U251MG(KO) 人類星形膠質細胞瘤細胞

U266 人骨髓瘤細胞

VCAP 人前列腺癌細胞

hTERT-HPNE 人胰腺導管細胞

ES-2 人卵巢透明細胞癌細胞

NCI-H1650人非小細胞肺癌細胞

H460 人大細胞肺癌細胞

HACAT 人永生化角質形成細胞

HCT116 人結腸癌細胞

HEK293 人胚腎細胞

HEPG2 人肝癌細胞

HGC27 人胃癌細胞(未分化)

HT-29 人結腸癌細胞

HUVEC 人臍靜脈內皮細胞

KYSE150人食道癌細胞

L02(HL7702)人正常肝細胞  

LOVO 人結腸癌細胞

MCF-10A人正常乳腺上皮細胞

MCF7人乳腺癌細胞

LX-2 人肝星狀細胞

MDA-MB-468人乳腺癌細胞

三、細胞系的維持、凍存與復蘇:

將無抗生素培養3周的細胞按常規方法凍存，并于1個月后復蘇，觀察細胞生長狀態。

四、結果

自建人喉癌細胞系LSC-1傳至第12代以后，細胞生長速度變慢，已貼壁細胞變圓、漂起、死亡，細胞間隙出現可運動的微小生物，但培養液依然清亮不渾濁，收取上清液離心，將沉淀物行常規血瓊脂培養， 24 h結果為無菌生長，培養5~7 d后開始出現灰白色細小菌落，光滑濕潤，有透明溶血環，全自動細菌鑒定儀生化鑒定條檢測為嗜麥芽寡養食單胞菌，該菌為非發酵革蘭陰性桿菌。細菌藥敏結果:在15種抗生素中，該菌僅對頭孢他啶、哌啦西林、頭孢哌酮/舒巴坦3種藥物敏感，其余均耐藥。

4.1 抗生素法除菌效果

經篩選， LSC-1細胞可耐受的抗生素zui佳抑菌濃度分別為:哌啦西林64 mg /L、頭孢他啶2 mg /L、頭孢哌酮/舒巴坦32 mg /L。LSC-1細胞在哌啦西林和頭孢他啶zui佳抑菌濃度中分別傳代一次，在頭孢哌酮/舒巴坦中傳代3次，并每種細胞各凍存3株。復蘇情況:哌啦西林3株均未貼壁，頭孢他啶兩株復蘇后貼壁，但生長一周后均出現細菌，細胞死亡;另一株第二次凍存，再次復蘇后生長良好，但抗生素撤離后出現細菌，經鑒定仍為嗜麥芽寡養食單胞菌。頭孢哌酮/舒巴坦3株復蘇后均能存活，但生長緩慢，一周傳代一次，仍有少量細菌，抗生素撤離后重又出現細菌污染。在3種抗生素中，頭孢哌酮/舒巴坦抗菌作用和細胞生長狀態zui好，頭孢他啶對細胞損傷較大，細胞表面粗糙，狀態較差。

4.2 抗生素聯合巨噬細胞吞噬法除菌效果

比較頭孢哌酮/舒巴坦和巨噬細胞先后使用和二者交替使用的除菌效果，并觀察細胞凍存復蘇后的傳代次數，具體方法為:頭孢哌酮/舒巴坦32 mg /L培養1次、2次、4次后，再分別與巨噬細胞共培養2次，各凍存1株;頭孢哌酮/舒巴坦和巨噬細胞交替培養3次，凍存1株。復蘇后細胞狀態:頭孢哌酮/舒巴坦和巨噬細胞依次使用者中，抗生素使用次數較多的細胞傳代次數較多(5代);二者交替使用的細胞狀態更好于前3株細胞，且傳代次數也zui多(6代)。然而所有細胞zui終因狀態不佳或污染重現而死亡。

4.3裸鼠體內接種法除菌效果

腫瘤細胞接種裸鼠體內40 d后開始出現腫塊， 60d長至1 cm3左右。處死動物取出腫物，瘤體質量0. 39 g，體積為0. 8 cm*0. 6 cm*0. 4 cm。將組織塊培養于含三抗的*培養基， 14 d后改用無抗生素培養，持續培養3周，細胞生長良好。之后自然傳代8次，凍存1個月后復蘇，細胞仍能貼壁生長。取上清液做細菌培養，結果為無菌生長。

五、 細胞形態及生物學特性

抗生素處理及裸鼠接種后的LSC-1細胞形態與LSC-1第三代基本相同，細胞呈多邊形，有鋪路石感。

免疫組織化學細胞角蛋白染色，裸鼠接種后的和抗生素處理的細胞均有AE1 /AE3陽性表達，但前者陽性比例(圖1H)與第三代細胞(圖1G)接近，后者陽性表達較少。

HE染色，接種裸鼠的LSC-1細胞具有高度的異型性:細胞形態及大小不等;核呈多形性:大小、形態及染色各異，胞核與胞質比例增大(接近1B1)，核仁粗大，數目增多，核分裂象增多，出現不對稱、多極性等病理性核分裂，偶見巨核細胞，胞質有糖原顆粒，與LSC-1第三代細胞形態相一致。

細胞倍體狀況及細胞增殖周期分析結果。

用頭孢哌酮/舒巴坦處理3次后， LSC-1細胞周期直方圖雖為近二倍體圖像，但S期、G2M期細胞峰較高，仍具有癌細胞的特點。裸鼠接種的LSC-1細胞呈現非整倍體圖像，且二倍體和異倍體的S期、G2M期峰均較高，更接近第3代LSC-1細胞周期DNA含量分布。3種細胞各核型比例:裸鼠接種細胞仍保持二倍體和異倍體核型，分別占44. 92%和55. 08%，與第3代細胞(二倍體41. 52%、異倍體58. 48% )基本相同，而頭孢哌酮/舒巴坦處理的細胞全部為二倍體，異倍體細胞消失。

六、討論

挽救污染細胞的方法有抗生素除菌法、巨噬細胞吞噬法和動物接種除菌法，其中較常使用的是抗生素沖擊法。清除效果的檢驗應包括無菌檢驗和細胞性狀評估。無菌檢驗指細胞在無抗生素培養基中傳代3~4次，顯微鏡下觀察無細菌、培養上清細菌無菌生長，方可確定污染細菌被消除干凈。細胞的組織來源鑒定和染色體分析是細胞系鑒定的兩個主要方面。LSC-1為喉鱗狀上皮來源細胞系，參照相關文獻，我們選用角蛋白免疫組織化學鑒定和細胞周期DNA倍體分析方法評估細胞性狀。

細胞系中麥芽窄食單胞菌有可能來源于標本本身。由于該菌對氨基糖甙類和很多B-內酰胺類(包括碳青霉烯類)天然耐藥，故常規培養液中的青、鏈霉素不能*抑制其生長。有研究顯示，該菌僅對少數幾種抗生素如頭孢哌酮/舒巴坦、頭孢他啶等耐藥性較低，本文得到了相同的結果。本實驗采用15種抗生素對該菌的抑菌效果進行測定，找出其中有效的3種，又分別對這3種抗生素的6個梯度濃度測試，zui后確定抗菌效果zui好、細胞毒性zui小濃度為32 mg /L頭孢哌酮/舒巴坦，其作用能控制細菌生長并使細胞傳代2~3代，當聯合使用小鼠巨噬細胞后又使細胞傳代次數增加到5~6代。然而，抗生素的作用主要是通過抑制細菌細胞壁的合成達到抑制細菌生長的效果，并不能直接殺死細菌。有研究表明，單獨使用抗生素處理細菌污染的KB口腔上皮樣癌細胞系，不能*清除細胞內的細菌。巨噬細胞在體外沒有其他免疫細胞和抗體等因素的參與下，其吞噬功能是有限的，在這里僅起到輔助抗生素的作用， (相關的報道有用于挽救支原體污染的細胞，但體外抗細菌的作用尚未見報道)，故當抗生素撤離后以上2種方法處理的細胞中細菌再次出現。

另外，抗生素對培養細胞的形態和性狀都有一定的影響。本實驗有效的3種抗生素中，頭孢他啶毒性zui大，頭孢哌酮/舒巴坦雖然毒性相對弱一些，但也使喉癌細胞角蛋白AE1 /AE3表達有所減少、DNA倍體分析原有的異倍體細胞消失，接種裸鼠后不能成瘤。因此可以認為，有針對性地使用抗生素或許可以短期控制住細胞系中污染細菌生長，但同時可能伴隨有細胞生物學特性變化。進而推論，抗生素沖擊法也難控制細菌再次暴發性生長，而且對細胞更有損傷。至于那些不做污染菌的分離和鑒定、僅靠單一某種廣譜抗生素來對付所有污染細菌，或是僅參照臨床用藥劑量來設計抗生素濃度等做法更不可取。

動物體內接種除菌法是利用動物的免疫系統來消滅污染微生物的方法。常用的動物裸鼠是先天性胸腺缺陷的突變小鼠，其T細胞缺如致使特異性細胞免疫功能喪失，但B細胞功能依然正常以及非特異性細胞免疫系統NK細胞活力強，故可用于腫瘤細胞的污染清除。細菌在裸鼠體內可被巨噬細胞和中性粒細胞吞噬、NK細胞殺滅、IgM、IgG類抗體結合病菌后激活補體殺死或溶解等。本實驗結果顯示，接種BALB /c-nu裸鼠之后的LSC-1細胞形態良好、生長旺盛，細胞間沒有細小微生物，傳代多達8次后，細胞凍存和復蘇仍能正常生長，并在抗生素撤離后細胞生長狀態不變，細菌培養為陰性。

細胞生物學特性上，細胞角蛋白陽性表達比例較高，與第3代LSC-1接近，保持了原有上皮來源的性質，組織病理學觀察仍具有高度的異型性及腫瘤細胞的特征，細胞倍體及增殖周期分析結果顯示異倍體細胞及S期細胞的比例與第3代細胞相同。實驗表明，利用裸鼠去除腫瘤細胞系中的污染細菌是zui為理想的方法，既能*清除污染細菌，又能保持腫瘤細胞的來源特征和惡性特性。